ОПТИМІЗАЦІЯ УМОВ ПОЛІМЕРАЗНОЇ ЛАНЦЮГОВОЇ РЕАКЦІЇ ДЛЯ ДОСЛІДЖЕННЯ МІКРОСАТЕЛІТНОЇ ДНК ВЕСЛОНОСА (POLYODON SPATHULA)

Bìol. Tvarin, 2017, Volume 19, Issue 2, pp. 56–63 http://dx.doi.org/10.15407/animbiol19.02.056

Bìol. Tvarin, 2017, Volume 19, Issue 2, pp. 56–63

http://doi.org/10.15407/animbiol19.02.056

ОПТИМІЗАЦІЯ УМОВ ПОЛІМЕРАЗНОЇ ЛАНЦЮГОВОЇ РЕАКЦІЇ ДЛЯ ДОСЛІДЖЕННЯ МІКРОСАТЕЛІТНОЇ ДНК ВЕСЛОНОСА (POLYODON SPATHULA)

Х.М.Курта, О.О.Малишева, В.Г.Спиридонов

Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам необхідно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

Українська лабораторія якості і безпеки продукції АПК,
Національний університет біоресурсів і природокористування України,
вул. Машинобудівників, 7, смт Чабани, Києво-Святошинський р-н,
Київська обл., 08162, Україна, Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам необхідно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

Веслоніс (Polyodon spathula) — цінний об’єкт штучного розведення та вирощування у рибницьких господарствах України. Визначення рівня генетичної мінливості його популяцій за допомогою нових молекулярно-генетичних підходів з використанням мікросателітних ДНК-маркерів є важливим завданням для оптимізації робіт з відтворення та збереження генофонду цього виду, ефективного культивування і підвищення обсягів виробництва цінної осетрової продукції.

Однією з умов успішної постановки полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) є оптимальний підбір режимів ампліфікації за температурою та тривалістю кожного з циклів, а також визначення складу реакційної суміші та концентрації відповідних реактивів. Варто зазначити, що ефективність ПЛР-реакції залежить передусім від таких складових: концентрація ДНК-матриці, концентрація йонів магнію (Мg²⁺) та температура відпалу праймерів.

Метою досліджень була оптимізація умов ПЛР і їх оцінка шляхом підбору мікросателітних ДНК-маркерів, умов ампліфікації та складу реакційної суміші для забезпечення максимальної специфічності та ефективності ампліфікації мікросателітної ДНК веслоноса (Polyodon spathula).

На основі порівняльного аналізу попередніх досліджень поліморфізму мікросателітних ДНК-маркерів різних популяцій веслоноса нами було визначено, що найбільш інформативними для подальших досліджень є такі ДНК-маркери: Psp12, Psp21, Psp26, Psp28. Для підібраних маркерів визначено оптимальні умови ампліфікації, а саме температурні режими і тривалість циклів полімеразної ланцюгової реакції. Визначено оптимальний склад та концентрації компонентів реакційної суміші. Згідно з результатами досліджень, було визначено ефективну температуру відпалу праймерів (Т_А) — 56 °С. Було встановлено оптимальні концентрації суміші праймерів по 5рМ/мм³ кожного та кінцеву концентрацію йонів магнію (Мg²⁺) на рівні 1,5 мМ у реакційній суміші загальним об’ємом 15 мм³. Отримані результати оптимізації умов ПЛР-ампліфікації мікросателітних локусів ДНК дозволять здійснювати подальші роботи з вивчення особливостей генетичної структури веслоноса для оцінки рівня генетичного поліморфізму цього виду риб в умовах сучасного ведення аквакультури.

Ключові слова: ВЕСЛОНІС, МІКРОСАТЕЛІТИ, ДНК-МАРКЕРИ, ПОЛІМЕРАЗНА ЛАНЦЮГОВА РЕАКЦІЯ, ГЕНОТИПУВАННЯ, ПОЛІМОРФІЗМ, ГЕНЕТИЧНА СТРУКТУРА

1. Dudu A., Suciu R., Parashiv M. Nuclear Markers of Danube Sturgeons Hybridization. Molecular Sciences, 2011, vol. 12, pp. 6796–6809. https://doi.org/10.3390/ijms12106796

2. Dyman T. M., Hlazko V. I. Polymerase chain reaction. Methodical recommendations. Bila Tserkva, 2004, 62 p. (in Ukrainian)

3. Glazko V. I., Glazko T. T. DNA-technology in genetics and breeding. Lectures, Krasnodar, VNII risa publ., 2006, 399 p. (in Russian)

4. Heist E. J. Nicholson E. H., Sipiorski J. T., Keeney D. B. Microsatellite markers for the paddlefish (Polyodon spathula), Conservation Genetics, 2002, vol. 3, pp. 205–207. https://doi.org/10.1023/A:1015272414957

5. Kaczmarczyk D., Kohlmann K., Kersten P., Luczynski M. Polymorphism of microsatellite loci — a tool in studying biodiversity of paddlefish aquaculture brood stock. Environmental Biotechnology, 2007, vol. 3, pp. 44–48.

6. Kaczmarczyk D., Luczynski M., Brzuzan P. Genetic variation in three paddlefish (Polyodon spathula, Walbaum) stocks based on microsatellite DNA analysis. Czech J. Anim. Sci, 2012, vol. 57 (8), pp. 345–352. https://doi.org/10.17221/6269-CJAS

7. Kurta K. M, Malysheva O. O., Spyrydonov V. G. Contemporary state and prospects of research of paddlefish (Polyodon spathula) genetic structure (a review). Scientific reports of NULES of Ukraine. 2016, no. 6 (63), 25 p. Available at: http://journals.nubip.edu.ua/index.php/Dopovidi/issue/view/308. (in Ukrainian)

8. Malysheva O. O., Spyrydonov V. G., Melnychuk S. D. Modern molecular genetics approaches for optimization of artificial reproduction of sturgeon species (for example, Sturgeon, Acipenser ruthenus, Linnaeus). Journal of the Institute of Animal Breeding and Genetics, 2014, no. 48, pp. 202–208. (in Ukrainian)

9. McPherson M. J., Moller S. G. PCR basics: From background to bench. New York, BIOS scientific Publishers Ltd, 2000, p. 276.

10. Tarasiuk S. I., Hrytsyniak I. I. Molecular-genetic studies in fish culture. A monograph. Kyiv, Agricultural Science, 2013, 312 p. (in Ukrainian)

11. Tretiak O. M., Hrytsyniak I. I., Tarasiuk S. I. Using DNA markers for studying the genetic structure of paddlefish (Polyodon spathula (Walb.)) brood stocks. Fisheries science of Ukraine, 2012, vol. 4, pp. 117–120. (in Ukrainian)

12. Tretiak O. M, Tarasiuk S. I. Analysis of the genetic structure of paddlefish’s brood stock for certain genetic and biochemical systems. Fisheries science of Ukraine, 2011, no. 1, pp. 50–57. (in Ukrainian)

скачати повний текст статті в форматі PDF

Біологія тварин

Search