УДК 577.112: 577.122: 579.222 http://dx.doi.org/10.15407/animbiol18.04.078
КІНЕТИЧНІ ПАРАМЕТРИ ІНУЛІНАЗНОЇ ТА ЛЕВАНАЗНОЇ АКТИВНОСТІ БАКТЕРІЙ РУБЦЯ БАРАНІВ ЗА ВПЛИВУ КЛІНОПТИЛОЛІТУ
М. Я. Сабат1, Р. Я. Іскра2
Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам необхідно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.
1Львівський національний університет ветеринарної медицини
та біотехнологій імені С. З. Ґжицького,
вул. Пекарська, 50, м. Львів 79010, Україна
2Інститут біології тварин НААН,
вул. Стуса, 38, м. Львів, 79034, Україна
Фруктани є групою полімерів фруктози, які синтезуються рослинами і мікроорганізмами. Фруктани рослин (інулін і флеїн) мають відносно низький ступінь полімеризації (до 40), а бактеріальні (леван) — високий (до 1000000). Мікроскопічні гриби, дріжджі і деякі бактерії, зокрема представники мікрофлори рубця, здатні виробляти інулінази, що руйнують різноманітні фруктани, та леванази, які гідролізують основний ланцюг левану.
Проведено визначення активності інулінази та леванази у безклітинному екстракті бактерій рубця баранів, яким упродовж двадцяти однієї доби згодовували природні фруктани та сорбент кліноптилоліт. Виконано кінетичний аналіз реакції гідролізу фруктанів інуліназою та леваназою, що проводили у стандартному середовищі інкубування, яке модифікували за фізико-хімічними параметрами (температура, pH) та вмістом субстратів. Визначали константу Міхаеліса за умов насичення субстратом (інуліном та леваном) та максимальну швидкість реакції гідролізу методом Лайнуївера-Берка. Було визначено температурний (37 °С) та pH-оптимум (4–6) активності інулінази та леванази.
Встановлено, що зі збільшенням концентрації як інуліну, так і левану від 0,1 до 0,4–0,5 мМ відбувалося монотонне наростання ензиматичних фруктангідролазних активностей до їх максимальних значень, після чого вони підтримувалися на незмінному рівні. Було виявлено, що інулін метаболізувався інуліназою з більшою швидкістю, порівняно з леваном, за умов насичення субстратом. Леваназа гідролізувала леван, проте була неактивною щодо інуліну. За наявності кліноптилоліту спорідненість обох гідролаз до субстратів підвищувалася.
Ключові слова: ФРУКТАНИ, ІНУЛІН, ЛЕВАН, КЛІНОПТИЛОЛІТ, РУБЦЕВИЙ МІКРОБНИЙ МЕТАБОЛІЗМ
1. Baran M., Kravtsiv R., Kalachnyuk G., Bomba A., Zitnan R. Optimisation of ruminant digestion by influencing the ruminal fermentation. Slov. Vet. J., 2008, no. 2, pp. 117–118. (in Ukrainian)
2. Ettalibi M., Baratti J. C. Molecular and kinetic properties of Aspergillus ficuum inulinases. Agric. Biol. Chem., 1990, Vol. 54, pp. 61–66.
3. Dai D., Nanthkumar N. N., Newburg D. S., Walker W. A. Role of oligosaccharides and glycoconjugates in intestinal host defense. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 2000, vol. 30, no. 2, pp. 23–33.
4. Safety evaluation of fructan. Tema Nord, 2000, 116 p.
5. Wanker E., Huber A., Schwab H. Purification and characterization of the Bacillus subtilis levanase produced in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology, 1995, Vol. 61, no. 5., pp. 1953–1958.
6. Alijev A. A., Kafarov M. S. The method of fractionation of proventriculus contents on components. Bull. farm animals, 1971, V. 5, pp. 69–72.
7. Vlizlo V. V., Fedoruk R. S., Ratych I. B. Laboratory methods of research in biology, animal husbandry and veterinary medicine. A guide. Lviv, Spolom, 2012, 764 p. (in Ukrainian)
8. Eisenberg V. L., Stojko V. I., Demidenok E. A. Methods of quantitative determination of the activity of the fungal inulinase using Sumner reagent. Biotechnology, 2007, no. 5, pp. 95–96. (in Russian)
9. Avigad G., Bauer S. Fructan hydrolase. Methods Enzymol., 1966, Vol. 8, pp. 621–628.
10. Cornish-Bowden A. Fundamentals of Enzyme Kinetics. 4th Edition. 2012, 510 p.
11. Wilkinson G. N. Statistical estimations in enzyme kinetics. Biochem. J., 1961, Vol. 80, p. 32.
12. Somogyi M. Notes on sugar determination. J. Biol. Chem., 1952, Vol. 195, pp. 19–23.
13. Stryer L. Biochemistry. W. H. Freeman & Co, New York, 1988.
14. Antosova M., Polakovic M Fructosyltransferases: the enzymes catalyzing production of fructooligosaccharides. Chem. Pap. — Chem. Zvesti, 2001, Vol. 55, pp. 350–358.
15. Farine S., Versluis C., Bonnici P. J. Application of high performance anion exchange chromatography to study invertase-catalysed hydrolysis of sucrose and formation of intermediate fructan products. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001, Vol. 55, pp. 55–60.
16. Pudjono G., Barwald G., Amanu S. Activity of inulinase of some strains of Bifidobacter iumand their effects on the consumption of foods containing inulin and other fructans. Inulin and inulin-containing crops. Amsterdam, Elsevier, 1993, pp. 373–379.
17. Muramatsu K., Onodera S., Kikuchi M., Shiomi N. Substrate specificity and subsite affinities offructofuranosidase from Bifidobacterium adolescentis G1. Biosci Biotechnol Biochem., 1994, Vol. 58, pp. 1642–1645.
